QTL
بزرگ حاصل از تلاقی دو لاین اینبرد که در اصلاح نباتات مرسوم است؛ استفاده می شود. این نرم افزار در جمعیت هایی که از یک تقسیم میوز حاصل شده اند؛ مانند تلاقی برگشتی و دابل هاپلوئیدها، و جمعیت F2 (با نشانرهای غالب و همبارز) و نیز جمعیت لاین های اینبرد به کار برده می شود.

ترسیم نقشه شامل چندین مرحله توالی می باشد:

1.      مپ میکر درصد نوترکیبی و امتیاز ال او دی برای تمام جفت نشانگرها را به صورت دو به دو محاسبه می کند.

2.      حد بالا برای نسبت نوترکیبی و حد پایین برای امتیاز ال او دی تعیین می شود.

3.      گروه های پیوسته ژنی به گونه ای مشخص می شوند که در هر یک نشانگرها به طور متوالی قرار گرفته باشند.

4.      مرحله بعدی عبارت است از مرتب کردن مکان های ژنی در درون هر گروه پیوسته ژنی.

5.   با افزایش تعداد نشانگرها در هر گروه پیوسته ژنی به بیش از 6 الی 7 نشانگر، محاسبه احتمال درست نمایی تمام ترتیب ها، غیرممکن خواهد بود. لذا در طی تهیه نقشه 6 الی 7 نشانگری که در گروه ها به خوبی توزیع شده اند؛ انتخاب می شوند. سایر نشانگرها براساس آنهایی که قبلاً منظم شده اند؛ جای داده  می شوند.

6.      زمانی که ترتیب نشانگرها مشخص شد؛ فاصله مابین آنها محاسبه می شود (فاصله هالمن یا کوزامبی).

توسط دستورات نرم افزاری ارائه نقشه ژنی با کیفیت بالا را ممکن می شود: یا با تغییرات جزئی با دستور "ریپل" (Ripple) و یا به وسیله تجزیه تغییراتی که از حذف هریک از نشانگرها نتیجه می شود با دستور "دراپ مارکر" (Dropmarker) جستجو برای وقوع کراسینگ اور مضاعف نزدیک هم با دستور "ارور دیتکشن" (Error detection).

البته دقت یک نقشه نه فقط به اندازه جمعیت، بلکه به وجود نشانگرهایی واجد اریبی معنی دار در تفرقشان و خطای تعیین ژنوتیپ بستگی خواهد داشت. در صورت وقوع خطای تعیین ژنوتیپ، فاصله افزایش می یابد. نسخه سوم نرم افزار مپ میکر دارای ابزار جستجو عملکرد تصحیح کننده برای خطاهای تایپی می باشد؛ در حالی که نرم افزار نسخه سوم جمندل (لیو و کناپ 1990) انحرافات تفکیک در F2 را محاسبه می کند.

سرانجام نرم افزارهای جوین مپ (Joinmap) و جیمندل می توانند با تلفیق اطلاعات چندین نقشه، نقشه ای مرکب را برای چند جمعیت ایجاد کنند. همچنین این نرم افزارها قادرند جوامع حاصل از تلاقی افراد هتروزیگوت را تجزیه کنند.

نرم افزاهای دیگر مثل Hypregene برای نمایش ژنوتیپ ها به صورت گرافیکی و نیز qGENE همه این ابزارهای نشانگری مهم DNA را در یک واحد منفرد جمع آوری می نماید.

موارد مهم جهت رسم یک نقشه پیوستگی با نشانگرهای DNA

الف. نشانگرهای مولکولی DNA

نشانگرهای مولکولی با عنوان رایج مارکرهای مولکولی از جایگاه بزرگی در علم اصلاح نباتات و مهندسی ژنتیک برخوردار شده اند. چرا که با استفاده از این ابزار به بسیاری از مسائل محدود کننده فائق آمده و در جهت به گزینی محصولات زراعی که هدف علم کشاورزی می باشد؛ کمک شایانی شده است.

نشانگرهای DNA مهم ترین نشانگرهای مولکولی می باشد و استفاده از این تکنولوژی رو به افزایش چشمگیری است. نشانگرهای DNA ابزار با ارزشی را جهت آزمایشات مختلف از بررسی های فیلوژنتیک تا کلونینگ موضعی ژن ها فراهم آورده است که از آن جمله می توان به برخی موارد مهم کاربرد در کشاورزی اشاره نمود:

1.                تهیه نقشه های ژنتیکی

2.                انتخاب به کمک نشانگر (جهت بهبود کیفیت تولید، گیاهان مقاوم به بیماری، بهبود عملکرد گیاه و غیره)

3.                هرم بندی ژن ها

4.                بررسی تنوع ژنتیکی

5.                طبقه بندی گیاهان زراعی الیت

6.                انتقال ژن

براساس کاربرد وسیع این تکنولوژی، نشانگرهای DNA را از حیث عمل به دو دسته عمده تقسیم می کنند:

1.                نشانگرهای مولکولی DNA غیرعملکردی

2.                نشانگرهای مولکولی DNA عملکردی

 1. نشانگرهای مولکولی غیرعملکردی

این گروه از نشانگرها گروه بزرگی را تشکیل می دهند که خود به دو دسته نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز و نشانگرهای DNA غیرمبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز تقسیم می شوند. از ویژگی های این نوع نشانگرها می توان توزیع آن در سراسر ژنوم، قطعه ای از ژنوم و نیاز به تعداد زیاد جهت مطالعات را نام برد.

 * نشانگرهای DNA بدون استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز

این دسته از نشانگرهای DNA بدون استفاده از روش واکنش زنجیره ای پلیمراز تولید و مورد استفاده قرار می گیرند که سرگروه  این دسته از نشانگرها همان تفاوت طول قطعات حاصل از هضم DNA توسط آنزیم های محدودگر می باشد که FRLP نامیده می شود. "پویش ژنومی نشانه های هضم" RLGS ، "تعداد متفاوت ردیف های تکراری" (VNTR) و "ماهوارک ها" (Minisatellites) از انواع دیگر این نوع نشانگرها می باشند.

 *نشانگرهای DNA با استفاده از واکنش زنجیره ای پلیمراز

واکنش زنجیره ای پلیمراز که بطور اختصاسی PCR خوانده می شود؛ روشی فوق العاده قوی می باشد که تکثیر ردیف منتخبی از مولکول DNA یک ژنوم را تا چندین میلیون برابر در مدت کمتر از نیم روز امکان پذیر می نماید. اما این فرآیند هنگامی امکان پذیر است که حداقل ردیف کوتاهی از دو انتهای قطعه DNA موردنظر معلوم باشد. در این نوع فرآیند که تقلیدی از فرآیند همانند سازی DNA در طبیعت می باشد، الیگونوکلئوتیدهای مصنوعی که مکمل ردیف شناخته شده دو انتهای قطعه موردنظر DNA می باشند، به عنوان آغازگر مورد استفاده قرار می گیرند تا واکنش آنزیمی همانندسازی DNA در درون لوله آزمایش امکان پذیر گردد. این همانندسازی یک فرآیند آنزیمی بوده و توسط انواع مختلفی از آنزیم های پلیمراز صورت می گیرد. امروزه تعداد زیادی از این نوع آنزیم ها به صورت تجاری در دسترس می باشند. این واکنش از آن جهت ارزشمند می باشد که عمل آن فوق العاده اختصاصی بوده، و به سادگی ماشینی شده و قادر است عمل تکثیر را از مقادیر فوق العاده کم DNA الگو آغاز نماید.

از نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره ای پلیمراز می توان به موارد زیر اشاره کرد: ALP یا تفاوت طول قطعات قابل تکثیر، تفاوت طول قطعات هضم شده فرآورده های واکنش زنجیره ای پلیمراز یا PBR، تفاوت فرم فضایی رشته های منفرد ، نشانگرهای RAPD، انگشت نگاری با DNA تکثیر شده یا DAF، تفاوت طول قطعات حاصل از تکثیر AFLP، ریز ماهواره، ... 
 

2. نشانگرهای مولکولی عملکردی

نشانگرهای مولکولی عملکردی شامل بخشی از ژن یا ژن های دخیل در یک مسیر بیوشیمیایی می باشند. به عبارت دیگر در این دسته از نشانگرها عملکرد ژن های فرض شده (کاندیدا) تا حدودی مشخص می باشد. از جمله این نشانگرها می توان به نشانگر RGA اشاره نمود.

ب. ژن های کاندیدا و اهمیت آنها

ژن های کاندیدا برای یک صفت خاص عبارتند از ژن های توالی یابی شده ای که فعالیت بیولوژيکی آنها شناخته شده است. فرضیه ژن کاندیدا پیشنهاد می کند که بخش اعظمی از تنوع ژنتیکی صفات کمی به واسطه تنوع اعمال ژن هایی است که مستقیماً در فیزیولوژی و یا توسعه صفت دخیل هستند. جستجوی اثرات ژن های کاندیدا مستلزم شناخت گسترده توالی های ژنومی و مکان های چند شکل در داخل ژن های کاندیدای شناخته شده می باشد. استفاده از ژن کاندیدا با جمعیت های تجاری و یا آزمایش های کوچک سازگار بوده و منجر به انتخاب به کمک نشانگر به طور مستقیم و طبیعی می گردد.

مزایای آنالیز با ژن کاندیدا

1.                قدرت آماری بالا

2.                کاربرد وسیع

3.                هزینه کم

4.                سادگی کار

محدودیت های آنالیز با ژن کاندیدا

1.                اثر ژن های غیر از ژن کاندیدا در بروز یک صفت

2.                هزینه زیاد در مطالعات اولیه ژن کاندیدا

3.                مشکل در تشخیص دقیق اثر ژن کاندیدا

ج. جمعیت نقشه

یکی از مهم ترین تصمیمات در رسم یک نقشه پیوستگی با نشانگرهای DNA یک جمعیت نقشه مناسب می باشد. به این منظور باید به چند عامل توجه گردد که مهم ترین آنها هدف پروژه نقشه می باشد. برای مثال، هدف این باشد که یک نقشه چارچوب به منظور تولید یک سری لوکوس نقشه یابی شده در آینده تولید گردد و یا شناسایی و تعیین نشانگرهای DNA مجاور ژن هدف برای کلونینگ براساس نقشه احتمالی و شاید هدف نقشه یابی لوسای صفات کمی (QTL) و یا نمایش چندین لوسای مقاوم به بیمای در فرآیند به هرم آوردن ژن ها باشد.

به هر هدفی عامل مسبب در پشت نقشه اثر مهمی روی والدین منتخب شده جهت تلاقی ها ، اندازه جمعیت، طریق پیشرفت تلاقی ها و انتخاب نسل مناسب برای آنالیز DNA و فنوتیپ دارد.

د. چند شکلی DNA در میان والدین

توالی کافی از چند شکلی DNA باید بین والدین موجود باشد، هرچند که آنالیز نقشه پیوستگی در غیاب چند شکلی DNA غیرممکن نیست. بطور طبیعی گونه های دگر گرده افشان نظیر ذرت ، سطوح بالایی از چند شکلی DNA را نشان می دهند و در اصل هر تلاقی که افراد منسوب با هم را شامل نشود، چند شکلی کافی برای نقشه کشی فراهم می آورد. اگرچه سطوح تنوع در توالی DNA  در گونه های اصلاحی عموماً کمتر می باشند و پیدا کردن چندشکلی مناسبی از DNA به راحتی امکان پذیر نیست.

گاهی جهت رسم نقشه ژنتیکی گونه های اصلاحی، لازم است که والدین تا جایی که ممکن است ارتباط دوری از هم داشته باشند که غالباً تنوع جغرافیایی، مورفولوژیکی یا آیروزایم استنباط می گردد. در برخی موارد نیز، ممکن است تلاقی های مناسب از قبل انجام شده باشد زیرا معرفی صفات مطلوب از خویشاوندان وحشی به ارقام زراعی یکی از اهداف مهم اصلاح گیاهان در گذشته بوده است. تلاقی های پیوسته و محدود رسم نقشه را در تلاقی های بین والدین نزدیک امکان پذیر می سازند.

ه. انتخاب جمعیت تفرق

هر زمان که والدین مناسبی انتخاب شده باشند؛ نوع جمعیت ژنتیکی برای استفاده در نقشه کشی پیوستگی باید در نظر گرفته شود. چندین نوع از جمعیت های ژنتیکی مناسب وجود دارند. ساده ترین آنها جمعیت های F2 حاصل از هیبریدهای F1 و نیز جمعیت های بک کراس می باشند. برای بیشتر گونه های گیاهی، جمعیت هایی نظیر اینها جمعیت های ساده ای جهت ترسیم نقشه می باشند اما عقیمی در هیبرید F1 ممکن است برخی از ترکیبات والدینی به ویژه در تلاقی های دور را محدود نماید.

مانع اصلی برای جمعیت های بک کراس و F2 این است که آنها دائمی نیستند یعنی بذر حاصل از خودباروری این افراد به درستی اصلاح نمی شود. با روش هایی مثل برش، کشت بافت یا گیاهان F3 بالک تا اندازه ای می توان به این محدودیت ها غلبه کرد و جمعیت پایداری از مواد گیاهی جهت خالص سازی DNA فراهم نمود. با این وجود اندازه گیری صفات به عنوان بخشی از یک نقشه QTL در چندین مکان یا بیشتر از چند سال، با جمعیت های F2 یا بک کراس مشکل یا غیرممکن است و به این دلایل، منابع همیشگی جهت ترسیم نقشه ژنتیکی ضروری است.

بهترین راه حل برای این برهان، استفاده از جمعیت های اینبرد می باشد که منبع دائمی را برای ترسیم نقشه فراهم می آورند. لاین های اینبرد نوترکیب (RI) حاصل از افراد F2 یک استراتژی مناسب می باشد. با وجود برخی مسائل در رابطه با این جمعیت ها من جمله صرف زیاد زمان حداقل در 5 نسل، تمایل برخی مناطق ژنوم به هتروزیگوس ماندن به مدت طولانی، و مشکل تولید این جمعیت ها در گونه های دگر گرده افشان اجباری، در مواردی که تولید جمعیت RI امکان پذیر است؛ بذور مربوطه بسیار متجانس و فراوان می باشند و برای تکمیل نقشه بین آزمایشگاه ها قابل انتقال هستند. به علاوه لاین های RI که در امتحانات مکرر و در چندین مکان و بیش از چند سال تولید می شوند ، جمعیت های مناسبی برای نقشه کشی QTL می باشند.

انواع مشابهی از جمعیت های اینبرد نظیر دابل هاپلوئیدها DH نیز که دارای خیلی از فواید مشترک با لاین های RI هستند قابل به کارگیری هستند.

و. اندازه جمعیت

هرگاه یک جمعیت مناسب برای نقشه کشی انتخاب شده باشد، اندازه جمعیت مناسب باید مورد توجه قرار گیرد. از آنجایی که وضوح یک نقشه و توانایی برای تعیین ترتیب نشانگرها به طور زیادی به اندازه جمعیت بستگی دارد؛ انتخاب در این مرحله مهم است. از نظر عملی اندازه جمعیت به لحاظ آماده نمودن DNA محدود می گردد. هرچه اندازه جمعیت بزرگتر باشد؛ نقشه کشی بهتر صورت می گیرد.

عموماً نقشه های ترسیم شده با جمعیت های کمتر از 50 فرد وضوح کمی دارد و اگر هدف از پروژه، نقشه کشی با وضوح بالا در نواحی ویژه ژنومیک باشد و یا نقشه کشی QTL های با اثر کم مدنظر باشد؛ جمعیت های خیلی بزرگ تر موردنیاز خواهد بود. برای مثال، مسگار و همکاران (1991) بیش از 1000 گیاه F2 را برای ترسیم یک نقشه با وضوح بالا آزمایش کردند. در اطراف ژن M1 گوجه فرنگی استابر و همکاران (1987) بیش از 1800 فرد F2 ذرت را برای پیدا کردن QTL هایی به اندازه 1% تنوع در ترکیبات عملکرد آنالیز کردند، و آلپرت و تنکسلی (1996) بیش از 3400 فرد را برای به دست آوردن یک نقشه مفصل در اطراف لوکوس وزن میوه آزمایش کردند.

ز. اثر کیفیت DNA در نقشه یابی

صرف نظر از نوع جمعیت یا نشانگر DNA ای که برای ترسیم نقشه ژنتیکی استفاده می شوند؛ باید توجه نمود که DNA باید ابتدا از گیاه منبع خالص سازی گردد. خوشبختانه گیاهان را می توان در خیلی از محیط ها و مکان های متفاوت کشت داد و مواد آغازین برای خالص سازی DNA را از آنها خارج نمود و این در حالی است که بیان نشانگرهای فنوتیپی نظیر صفات مقاوم به بیماری یا مورفولوژیکی، بطور زیادی به شرایط رشد بستگی دارد.

امروزه محققین بیشتر به طرف نشانگرهای بر پایه واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) متمایل شدند که همگی آنها به مقادیر کمی از مواد آغازین و تکنولوژی های ساده تر استخراج نیاز دارند.

با این روش ها می توان به طور ساده و سریع با مقدار کمی از ماده آغازین به هدف مطلوب رسید که این در آنالیز جمعیت های بزرگ و در مواردی که مقادیر زیاد به سختی حاصل می شوند؛ نظیر بذور، گیاهچه یا گیاهان کوچک جثه مثل آرابیدوسپس، امر مهمی محسوب می شود.

نیازی نیست که DNA مورد استفاده در ترسیم نقشه های پیوستگی خیلی خالص باشد اما یک فرآیند استخراج باید مقدار مناسب کمی و کیفی DNA جهت هضم آنزیم برشی یا به عنوان الگو در PCR فراهم آورد. استخراج DNA می تواند از جمله مسایل محدودکننده در آنالیز با نشانگر ال باشد. مثلاً هضم ناقص DNA در کار با نشانگر RFLP و وضوح کم باندهای حاصل از توالی تک نسخه ای به خاطر مقدار کم DNA در این نشانگر، منتج به تصمیم گیری های نادرست می شود. باندهای غیرطبیعی و یا غیرقابل تجدید در کار با نشانگرهای براساس DNA مثل رپید، حضور یا غیاب محصولات DNA ، سنتز پرایمر– دایمرها به خاطر غلظت کم DNA الگو و غلظت بالای پرایمر در PCR و نیز آلودگی های ناشی از DNA خارجی همگی عواملی هستند که لزوم دقت در زمینه نشانگرهای DNA را باعث می گردند. بهینه سازی و استاندارد نمودن واکنش های PCR باید به طور دقیق و درستی صورت گیرد و جهت رسم نقشه همواره باید برجسته ترین و مطمئن ترین باندها در نظر گرفته شوند.

نشانگرهای SSR غالباً به عنوان پایه ای جهت خیلی از نقشه های چارچوب پیوستگی در نظر گرفته می شوند.

ح. تشکیل گروه های پیوستگی

بعد از برآورد میزان نوترکیبی ها باید وجود پیوستگی را مورد بررسی قرار داد؛ یعنی پیوستگی های جفت جفت نشانگرها را در مقابل عدم پیوستگی شان محاسبه نمود که این کار در دو سطح درست نمایی پیوستگی های دوگانه و سپس تعیین درست نمایی پیوستگی تلفیقی مجموعه ای از نشانگرها انجام می گیرد.

بنابراین در تجزیه پیوستگی، درست نمایی عبارت از: محاسبه احتمال وجود یک نقشه براساس داده های موجود است؛ ولی می توان وجود بهترین نقشه را با درست نمایی حداکثر ML تعیین نمود. منظور از بهترین نقشه، نقشه ای است با بیشترین میزان درست نمایی (که اگر امکان شمارش عینی نوترکیب ها فراهم باشد؛ این نقشه بدست خواهد آمد؛ بنابراین روش حداکثر درست نمایی تعمیم شمارش نوترکیبی به شمار می رود) که از آن مقادیری از نوترکیبی به دست می آید که در محدوده صفر تا 5/0 قرار دارند.

در واقع الگوریتم برآورد بهترین درست نمایی بر مبنای برآورد بهترین درست نمایی LOD تنظیم شده است. مطابق تعریف LOD عبارت است از Log پایه 10 نسبت L1 یعنی حداکثر درست نمایی مشاهده شده برای وجود پیوستگی به L یعنی درست نمایی برآورده شده برای فرض صفر (عدم وجود پیوستگی).

ط. کارایی نشانگرها در پوشش دهی ژنوم

هرگاه تعداد گروه های پیوستگی با تعداد کروموزوم های گامتی برابر باشد؛ گفته می شود که نشانگرها توانایی پوشش دهی خوبی بر کل ژنوم دارند. ولی اگر نشانگرهایی که باید روی کروموزوم باشند در دو گروه پیوستگی یا بیشتر قرار گیرند. یعنی زیرگروه های آنها به حدی به یکدیگر نزدیک نیستند که به صورت مجتمع روی یک کروموزوم تشخیص داده شوند. همچنین دقت یا مقیاس نقشه از تعداد نشانگرها بر کل طول ژنوم به دست می آید یعنی به طور متوسط فاصله جفت نشانگرها از یکدیگر چه قدر است که رابطه مستقیمی با تعداد نشانگر وارد شده به نقشه دارد.

به طور کلی در هر پروژه نقشه یابی عواملی وجود دارد که ممکن است دقت نقشه به دست آمده را تحت تأثیر قرار دهد؛ این عوامل به طور خلاصه عبارتند از: دقت در داده برداری، تغییرات ساختاری، اثر جنسیت، نوع جمعیت، اثر عوامل محیطی و غیره.

منابع

1- سید طباطبایی،ب.ا.شاه نجات بوشهری،ع.ا.1382.ترسیم نقشه ژنتیکی جو براساس نشانگرهای AFLP ،مجله علوم کشاورزی ایران،جلد34،شماره1،صفحه 18-9 .

2- علوی،س.م،سلطانی نجف آبادی.م،ع،ملبوبی.ع،ر،زمردی پور.1380.اصول کاوش ژنوم.نوشته سیدنی پرایمرز.انتشارات مرکز ملی تحقیقات مهندسی ژنتیک و تکنولوژی زیستی.

3- فیاض،م.1377.تهیه نقشه ژنتیکی گندم با نشانگرهای AFLP,RGA .پایان نامه کارشناسی ارشد.پردیس کشاورزی و منابع طبیعی کرج.دانشگاه تهران.

4- نقوی،م،ر.ب،قره یاضی.ق،حسینی سالکده.1384.نشانگرهای مولکولی.انتشارات دانشگاه تهران.

5- Anderson , L .1994. Genetic mapping of quantitative trait loci for growth and fatness in pigs.Science 263:1771-1774

6- Bhavani,S.Gowd,A .2002. Isolation sequence analysis and linkage mapping of resistance-gene analogs in Cowpea.Euphytica .126:365-377.

7- Bor-Yaw, lin. S,J,Change .2001. RFLP mapping of centromer of chromosome 1,6 and 9 by B-A translocations in maiz .Bot.Bull. Acad. Sin.42:273-279.

8- Clin,j.2005.Linkage disequilibrium maps & association mapping .Invest.

9- Fletcher , d .1994. Chromosome and genetic mapping.Woodrow Wilson Biology Institue.

10-Gail,M.K,Krigberg.J,Samet.A,Tsialis.W,Wong.2007.Statistical genetic of quantitative traits linkage,maps,QTL.Springer Science+ Business Media ,LLC.

11- Maksem, kh .2005. The handbook of plant genome mapping.Wiley-vch vorlag GmbH & Co.K GaA.

 

|+| نوشته شده توسط ع. آرمينيان (Ph.D) در یکشنبه ۲۰ اسفند ۱۳۸۵ و ساعت 14:0